三、填空题

1 ．只要 DNA 或 RNA 的单链分子之间存在着一定程度的__________ ，就可以在不同的分子间形成__________ 。

2 ．利用__________ 使胶中的生物大分子或大分子的片段__________ ，可使之成为固相化分子。

3 ．存在于 NC 膜上的生物分子可以放到杂交液中，与__________ 进行__________ 。

4 ． Southern blotting 主要用于__________ 的分析，也可以用于__________ 。

5 ． Northern blotting 主要用于检测__________ 的表达水平以及比较__________ 表达情况。

6 ．蛋白质的印渍分析，也称为__________ 或v 。

7 ．目前 DNA 序列的手工测定或自动化测定所基于的技术原理一为 __________，二为__________ 法。

8 ．限制性片段长度多态性分析（ RFLP ）是利用__________ DNA 分子再经__________ 即可检测出突变 DNA 。

9 ．基因转移技术包括__________ 水平的基因转移，而且可以进行__________ 水平的转移。

10 ．在转基因技术中，被导人的目的基因称为__________ ，目的基因的受体动物称为__________ 。

11 ．单链构象多态性分析（ SSCP ）的原理基于 DNA 单链具有__________ 特点，这种特点的形成取决于__________ 。

四、名词解释题

1 ． DNA 印渍技术

2 ． RNA 印渍技术

3 ．蛋白质印渍技术

4 ．探针（ probe ）

5 ．人类基因组计划

6 ．后基因组研究

7 ． gene knock out

8 ．限制性片段长度多态性分析（ RFLP ）

9 ．核转移技术

10. DNA 芯片

11 ．单链多态构象分析（ SSCP ）

五、问答题

1 ．核酸分子杂交的主要实验方法有哪些？主要用途是什么？

2 ．基因转移和基因剔除技术在医学上可能有哪些用途？

3 ．简述 RFLP 和 SSCP 检测基因突变的原理。

4 ．人类基因组计划的目的是什么？对于医学发展将会带来哪些影响？

5 ．简述 DNA 末端合成终止法测定 DNA 序列的原理？

6 ．后基因组研究包括哪些研究内容？

参考答案

三、填空题

1 ．碱基配对关系 杂化双链

2 ．毛细作用 NC 膜上

3 ．探针 杂交反应检测

4 ．基因组 DNA 分析重组质粒和噬菌体

5 ．检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA 的表达水平 不同组织和细胞同一基因的表达情况

6 ．免疫印渍技术 Western blotting

7 Maxam 和 Gilbert 所建立的化学裂解法 由 Sanger 建立的 DNA 链末端合成终止法

8 ．限制性核酸内切酶消化 琼脂糖电泳分离

9 ．细胞水平 整体动物水平

10 ．转基因 转基因动物

11 ．折叠并形成一定构象的特点 DNA 的碱基组成

四、名词解释题

1 ． DNA 印渍技术也称为 Southern blotting ，是将基因组 DNA 经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，再利用毛细作用将胶中的 DNA 分子转移到 NC 膜上进行杂交反应的技术。主要用于基因组 NDA 的分析。

2 ． RNA 印渍称为 Northern blotting ，指 RNA 经电泳分离后转移至膜性支持物上用于杂交反应的技术，目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA 的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。

3 ．蛋白质印渍分析也称为 Western blotting 或免疫印渍技术，指蛋白质在电泳分离之后转移到 NC 膜上，再与溶液中的其它蛋白探针相互结合的技术。免疫印渍技术在检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白分子间的相互作用研究中都有广泛的作用。

4 ．用同位素、生物素或荧光染料标记 DNA 分子的末端或全链的一段多聚核耷酸可以称为探针，用于与已经用印渍技术固定在 NC 膜上的 DNA 或 RNA 进行结合反应。蛋白质的检测常用抗体作为探针。

5 ．人类基因组计划是美国科学家首先提出并开始实施的一项全球性合作研究项目。它的具体研究内容包括（）建立高分辨率的人类基因组遗传图；（ 2 ）建立人类所有染色体的物理图谱；（ 3 ）完成人类基因组的全部序列测定；（ 4 ）发展取样、收集、数据的储存及分析技术。

6 ．后基因组研究是在人类基因组计划近于完成后提出的新的研究目标，将涉及功能基因组学、蛋白质组学、蛋白质的空间结构的分析与预测、基因表达产物的功能分析、细胞信号转导机理研究等。

7 ．有目的去除动物体内某种基因的技术称为基因剔（敲）除或基因靶向灭活，它的基本原理是建立在同源重组技术上。这种基因靶向灭活技术可以在细胞水平进行，从而建立新的细胞系；也可以在整体水平进行以建立基因剔除动物。

8 ．限制性片段长度多态性分析（ RFLP ）是利用限制性核酸内切酶消化 DNA 分子，再经琼脂糖电泳分离可显示出与正常个体不同的突变 DNA 的电泳谱型。凡是有限制性内切酶位点变化的突变均可以用此方法进行检测。

9 ．核转移技术是将动物体细胞胞核全部导人另一个体的去除了胞核的受精卵内，使之发育成个体。这样的个体所携带的遗传性状仅来自一个父亲或母亲个体，因而为无性繁殖。从遗传角度上讲，是一个个体的完全拷贝，故称之为克隆（ clone ）

10 ． DNA 芯片可以在小面积的表面固定数千甚至上万个探针用于细胞样品中基因表达谱及基因突变的分析。生物芯片对核酸的研究工作以及未来的诊断技术都将产生革命性的影 响。

11 ．单链构象多态性分析（ SSCP ）是在疾病相关基因分析与克隆中常用的另一种方法。如果一段基因中的碱基序列有所变化，可能会导致一定程度的构象变化，当用聚丙烯酸胺凝 胶电泳分离时，就会出现与原有 DNA 区带不同的迁移率。因此， SSCP 分析也可以检出在一段 DNA 分子中存在的突变。

五、问答题

1 ．目前常用的生物大分子印渍技术包括：（ 1 ） DNA 印渍技术（ DNA blotting ），被广泛称为 Southern blotting 。它主要用于基因组 DNA 的分析，尤其是用于某种基因在基因组中的定位研究，也可以用于分析重组质粒和噬菌体。（ 2 ） RNA 印渍技术（ RNA blotting ），也称为 Northern blotting 。 RNA 印渍技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA 的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。（ 3 ）蛋白质的印渍分析，也称为免疫印渍技术（ immunoblotting ）或 Western blotting 。主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白分子的相互作用研究等。

斑点印渍、原位杂交也是常用的分子杂交方法。在此基础上发展起来的 DNA 芯片可以在小面积的表面固定数千甚至上万个探针用于细胞样品中基因表达谱及基因突变的分 析。生物芯片对核酸的研究工作以及未来的诊断技术都将产生革命性的影响。

2 ．基因转移技术和基因剔除技术无疑在探讨每一种基因产物的正常功能方面具有重要的作 用，同时对于医学的发展也具有重大的推动作用。这两项技术在医学中最重要的应用是建立疾病的动物模型。这些动物模型对于探讨疾病的发生发展机理和过程十分重要。另外，更为重要的是可以作为新的治疗方法和新药物的筛选模型。以往的疾病动物模型主要是自然发生，或用化学药物放射线诱导等方式获得。转基因技术和基因剔除技术为直接建立这些动物模型提供了有效的手段。

3 ．限制性片段长度多态性分析的基本原理是当 DNA 序列中某一个碱基发生突变时，可能使突变所在部位的 DM 序列获得或丢失某种限制性核酸内切酶的识别位点，或者当 DNA 分子内部发生较大的顺序突变如缺失、重复、插人以及 DNA 高变区内某些重复顺序的拷贝数改变时，则会引起其限制性核酸内切酶位点发生相对位移。在上述两种情况下，突变个体来源的 DNA 分子经限制性核酸内切酶消化后，再经琼脂糖电泳分离后可显示出与正 常个体不同的电泳谱型，再结合 DNA 印渍技术即可获得疾病相关基因的信息。单链构象 多态性分析的原理是基于 DNA 单链具有折叠并形成一定构象的特点，这种构象的形成取决于 DNA 的碱基组成。如果一段基因中的碱基序列有所变化，可能会导致一定程度的构象变化，当用聚丙烯酸胺凝胶电泳分离时，就会出现与原有 DNA 区带不同的迁移率。因此， SSCP 分析可以检出在一段 DNA 分子中存在的突变。

4 ．分析出人类基因组 24 条染色体，约 30 亿对核音酸的 DNA 分子的全部序列。这项工作对于认识各种基因的功能，了解基因表达的调控方式，理解生物进化的基础，进而阐明所有生命活动的分子基础无疑具有十分重要的意义。人类基因组计划的具体研究内容包括 (1) 建立高分辨率的人类基因组遗传图；（ 2 ）建立人类所有染色体的物理图谱；（ 3 ）完成人类基因组的全部序列测定；（ 4 ）发展取样、收集、数据的储存及分析技术。人类基因组计划的实施大大促进了医学的发展， DNA 的遗传作图和物理作图对于认识疾病相关基因具有巨大的推动作用。遗传性疾病的基因定位，尤其是多基因复杂性状的基因位点也将在全基因组定位扫描中得到充分认识。例如高血压、糖尿病等吸引着众多的医学家和药物学家从分子水平对这些疾病的认识，从而改变传统治疗方式。

5 ．这种方法由 Sanger 建立的，因而也称为 Sanger 法，是目前应用的最为广泛的方法。它的基本原理是利用四种 2 '， 3 '一 双脱氧核苷酸（ ddNTP ）代替部分脱氧核苷酸（ dNTP ）作为底物进行 DNA 合成反应。一旦 2 '， 3 '一 双脱氧核苷酸参人到合成的 DNA 链中，由于核糖的 3 '位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，因此合成反应终止。测定时首先将膜板分为四组，加人 32 P 或 35 S 标记的引物启动 DNA 的合成，一定时间后，每一管内加人四种 ddNTP 的一种，如果 ddNTP ： dNTP 的比例适当，就可获得在不同部位终止的大小不同的 DNA 链。经聚丙烯酸胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影就可以读出一段 DNA 的序列。

6 ．后基因组的研究工作目前主要涉及以下几个方面：（ 1 ）功能基因组学将揭示不同细胞在不同的发育阶段，在不同的生理病理条件下的基因表达状态，从而深人认识这些基因在发育、分化、病理等状态下的功能变化，认识其表达调控方式及调控机理。（ 2 ）蛋白质组学是后基因组研究中的一个重要内容，是研究不同生命时期，或正常、或疾病、或给药前后细胞和组织中蛋白质的表达变化。（ 3 ）蛋白质的空间结构的分析与预测。（ 4 ）基因表达产物的功能分析。（ 5 ）细胞信号转导机理研究。后基因组研究的进展为医药学发展将提供更多的线索和机遇。