实验二 T克隆绿色荧光蛋白（ GFP ）基因

【原理】

　　经 Taq DNA 聚合酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单个 A 。正是基于这一原理， pGEM-T 质粒经 EcoR V 切成平端后，在开口端加上一个 T 制成 T 载体，一方面避免了自身环化，另一方面由于 T-A 互补，从而提高了 T 载体与 PCR 产物之间的连接效率。由于 T-A 克隆只需纯化 PCR 产物，因而操作较为简便。

pGEM-T vector 含丝状噬菌体 f1 的复制起始区，用于产生环状 ssDNA ；含有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶启动子；在多克隆区域具有编码 β- 半乳糖苷酶的基因 (LacZ) ，插入失活 α- 肽可在指示平板上通过蓝、白菌落直接筛选重组菌落。

转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。

实验采用 CaCl 2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于 0 ～ 4℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

pGEM-T Vector 图谱 :

pGEM-T 多克隆位点的序列：

【试剂与器材】

1 ．绿色荧光蛋白基因 PCR 产物，浓度为 5ng/μl 。

2 ． T4 连接酶（购买 Taq 酶有配套的 10×buffer ）。

3 ． 10×buffer 浓度（购买 T4 连接酶有配套的 Buffer ） :

（ 66mmol/L MgCl ， 660mmol/L Tris-Cl(pH7.6) ， 100mMDTT ， 1mMATP ）。

4 ．消毒三蒸水

5 ． LB 液体培养基 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。

6 ． LB 固体培养基 LB 液体培养基中加 1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。

7 ． 0.1mol/L CaCl 2 高压灭菌消毒或过滤除菌。

8 ．氨苄青霉素 用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml 溶液，置 -20℃ 保存。

9 ．大肠杆菌 DH5α 此为 DNA 扩增菌。

10 ．超净工作台

11 ．高速冷冻离心机

12 ．恒温摇床

13 ．恒温箱

14 ．恒温水浴箱

15 ．消毒离心管

16 ．消毒 tips

17. 玻璃培养皿 直径 90mm

18 ．玻璃涂布器和 95% 乙醇

19 ．标记笔

20 ．各种国产或进口移液器 (10 ， 20 ， 100μl)

21 ．消毒的 0.2ml PCR 管。

【操作步骤】

1 ．细菌感受态细胞的制备

将 DH5α 和 BL21 （ DE3 ）菌种分别划线于 LB 琼脂板上， 37℃ 培养过夜。挑取单菌落接种于 5ml LB 培养基中， 37℃ 振荡培养培养过夜。次日取菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培养基的烧瓶中， 37℃ 剧烈振荡培养至约 2 ～ 3h ，待 A 600 值达到 0.3 ～ 0.4 时将烧瓶置于冰浴 10 ～ 15min 。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的 50ml 离心管中。 4 000×g ， 4℃ 离心 10min ，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/L CaCl 2 重悬菌体，置冰浴 30min 。 4 000×g ， 4℃ 离心 10min ，弃培养基。再加 4ml 预冷的 0.1mol/L CaCl 2 ，轻轻重悬菌体，置 4℃ 冰箱 12 ～ 16h 。

2. PCR 产物与 T 载体连接

在 0.2ml 或 0.5ml 反应管中加入下列成分 :

pGEM-T 50ng

　　　　纯化的 PCR 产物 10-50ng

T4 连接酶 2-3weiss units

10× 连接缓冲液 1μl

补超纯水至总体积为 10μl ，常温下放置 30 分钟以上；也可以 16℃ 或 4℃ 过夜。

3 ．重组子的转化

在无菌条件下按每管取 100μl 新鲜感受态细菌置于无菌的 1.5ml 塑料离心管中，共 2 管，分别加入连接产物和消毒水 ( 作阴性对照 ) 各 5μl ，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min 。 42℃ ，热休克 90s ，中途不要摇动离心管，每管加 800μl 无抗生素的 LB 培养基，于 37℃ 空气摇床中以 150 r/min 速度振摇 45min ，使细菌复苏。每管取 200μl 加至含氨苄青霉素（ Amp ）的 LB 琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置 20min ，使液体吸收，然后 37℃ 倒置培养 12 ～ 16h 至单菌落形成。