实验十药物诱导细胞凋亡时 Bcl-2 蛋白含量的变化

【原理】

Western 印迹法，把聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的组分从凝胶转移至一种固定支持体，以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。对于蛋白质来说，通常使用的 探针是抗体，它与附着于支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。

【试剂与器材】

1•  细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0

2•  2× 上样 buffer ： 10 0 mmol/L Tris-HCl, pH6.8 ， 200 mmol/L DTT, 4%SDS ， 0.2% 溴酚蓝， 20% 甘油

3•  分离胶：水， 30% 丙烯酰胺溶液， 1.5mol/L Tris(pH8.8) ， 10%SDS ， 10% 过硫酸铵， TEMED

4•  浓缩胶：水， 30% 丙烯酰胺溶液， 1.0mol/L Tris(pH8.8) ， 10%SDS ， 10% 过硫酸铵， TEMED

5•  1× 电泳 buffer ： 25mmol/L Tris-Hcl, pH8.0, 250mmol/L 甘氨酸 , 0.1%SDS, pH8.3

6•  电转移 buffer ： 39mmol/L 甘氨酸 , 48mmol/LTris-Hcl, 0.037%SDS, 20% 甲醇

7•  封闭液： 5% 脱脂奶粉， 0.02% 叠氮钠， 0.02%Tween-20 溶于 PBS

8•  漂洗液 Ⅰ(0.01mol/L PBS ， pH7.2 )

9•  漂洗液 Ⅱ(150mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-Cl, pH7.5 )

10•  二抗稀释液 (5% 脱脂奶粉 ， 0.02%Tween-20 ， 150mmol/LNaCl, 50mmol/LTris-Cl, pH7.5)

11•  ECL 显色液：试剂盒

12•  微型垂直板电泳槽

【操作步骤】

(1) 样品制备

将细胞以 4 .0×10 8 /L 密度接种于用 12 孔培养板中，每孔 3 mL ， 37℃ 、 5%CO 2 孵箱中培养 至细胞贴壁，加入长春新碱，使之终浓度分别为 0 、 10 、 100 μg /mL 。继续培养过夜。弃去培养基，以冷 PBS(pH7.2) 洗涤细胞，每孔加入 100 μL 细胞裂解液 , 用细胞刮刮下细胞， -20℃ 放置 20 min, 将裂解液收集于 1.5mL 的 EP 管中，冰上超声破碎细胞（ 10s/ 次 ×3 次，间隔 15s ）， 4℃ ， 12 000×g 离心 5min ，收集上清液，蛋白质 样品与等体积 2× 上样 buffer 混匀，煮沸 5min ， 紫外分光光度法测定蛋白质浓度（ A 215 /A 225 ）。立即上样或将样品保存于 -20℃ 备用。

(2) SDS-PAGE

采用微型垂直板电泳槽制备 0.75mm 厚的凝胶。首先制备 10mL 12.5% 分离胶，混匀后立即灌胶，小心加蒸馏水覆盖，室温聚合 30min ，胶聚合后，倾去蒸馏水。制备 5mL 5% 成层胶，插入样品梳，避免产生气泡，室温聚合 40min ，小心取出样品梳，用蒸馏水小心冲洗加样孔数遍后，将凝胶板装到电泳槽上，加入 1× 电泳 buffer 。 上样 50μg/ 孔。 恒压 200V 电泳约 45 min ，当溴酚蓝到达分离胶底部时，关闭电源，小心剥离凝胶。

(3) 用考马斯亮蓝 R-250 对凝胶染色及脱色

(4) 转膜

按照凝胶 >NC 膜 > 滤纸的顺序，剪好一张 NC 膜（标记一角）和 6 张新华滤纸，将 NC 膜在蒸馏水中浸泡 5min 以消除气泡，同时用电转移 buffer 浸泡滤纸、凝胶、吸水海棉层。按说明书装好电转移槽， 将黑色多孔塑料夹放在最底层，再依次放置吸水海棉层、 3 层滤纸、凝胶、 NC 膜、 3 层滤纸、海棉层、无色多孔塑料夹，注意赶气泡，合拢好夹子放入电转移槽中 ( 黑的靠黑的，白的靠红的 ) ，正确连接电极，即胶朝阴极， NC 膜靠阳极，使凝胶上的蛋白质向 NC 膜印迹转移。 100V 恒压，加冰条件下电转移 3h 。起始电流应小于 250mA ，结束电流不应超过 400 mA 。

(5) 免疫印迹

从电泳槽上取出 NC 膜，用 PBS 洗 2 次，以除去 NC 膜上的凝胶。装 NC 膜于一可加热封接的塑料袋中，加入封闭液 (5% 脱脂奶粉， 0.02% 叠氮钠， 0.02%Tween-20 溶于 PBS) ，放在平缓摇动的摇床封闭 3h 。封闭结束，将膜转移至新的可加热封接的塑料袋中，按 0.1mL/cm 2 的量加入封闭液和适量的第一抗体（兔抗大鼠 Bcl-2 单克隆抗体 1∶200 ），封口， 4℃ 振摇过夜。剪开塑料袋，用约 200mL 漂洗液 Ⅰ 洗 3 次，各 10min ，以除去过量的一抗。用漂洗液 Ⅱ 洗 3 次，每次 10min ，除去 NC 膜上的磷酸盐及叠氮钠。将膜转入另一塑料袋，加入溶于二抗稀释液的二抗 (1∶5 000) ，封口，室温平缓摇动 1h 。取出 NC 膜，用大量漂洗液 Ⅱ 洗 5 次，各 10min ，以除去未结合的二抗。将 ECL 显色液Ａ与Ｂ临用前等量混合，浸泡膜 1min ，暗室 X-ray 胶片曝光，显影、定影，翻拍成照片，永久保存或成像系统成像保存。