实验八 PCR 扩增 DNA 【原理】 PCR 即聚合链式反应，它是近年来发展起来的一种体外扩增特异性 DNA 扩增技术。 PCR 技术实际上是在模板 DNA 、引物和４种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。 PCR 技术的特异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反应分 3 步：①变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA ；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板 DNA ，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在 DNA 聚合酶和 4 种 dNTP 底物及 Mg 2+ 存在的条件下， 5' → 3' 的聚合酶催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应，以上 3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性 DNA 片段得到了大量复制，数量可达 2 × 10 6 ～ 7 拷贝。 蛋白激酶 CK2 是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝 / 苏氨酸蛋白激酶。它是由两个催化亚基 ( α或α ') 和两个调节亚基 ( β ) 构成的不均一四聚体。通过 RT-PCR 可从人的肿瘤细胞中扩增出人的 CK2 β亚基 cDNA ，通过与 pT7-7 载体定向克隆并经测序确证得重组人蛋白激酶 CK2 β亚基 cDNA 质粒（ pTCKB ， 3087 bp ）。本实验利用此重组质粒 pTCKB 作为 DNA 的扩增模板，加入人蛋白激酶 CK2 β亚基 cDNA 的上游和下游引物和 4 种 dNTP 底物，在 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。理论上扩增的 PCR 产物大小为 672bp 。 【试剂与器材】 1 ．上游引物 : 5' AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT 3' ，其序列含人蛋白激酶 CK2 β亚基 cDNA 编码区起始的 20 个核苷酸，其 5' 端含 Nde I 酶切位点。浓度为 5 pmol/ μ l 即 5 μ mol/L ， 50 μ l 反应液中加 25pmol 。 2 ．下游引物 : 5' AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG 3' ，与人蛋白激酶 CK2 β亚基 cDNA 编码区最后 21 个核苷酸互补，其 5' 端含 Hin d Ⅲ酶切位点。浓度为 5 pmol/ μ l 即 5 μ mol/L ， 50 μ l 反应液中加 25pmol 。 3 ． DNA 模板：重组人蛋白激酶 CK2 β亚基 cDNA 质粒 (pTCKB ， 3087 bp) ，浓度为 2ng/ μ l ， 50 μ l 反应液中加 10ng 。 4 ． Promega 的 10 × buffer 浓度（购买 Taq 酶有配套的 Buffer ） : 500mmol/L KCl ， 100mmol/L Tris-Cl ， pH9.0 ， 1% Triton-X 100 5 ． 10 × MgCl 2 即 25mmol/L 。 6 ． dNTP 2.5mmol/L 分别取等体积的 10mol/L 的 dATP ， dGTP ， dTTP ， dCTP 四种混合即成 7 ． Taq DNA 聚合酶（国产或进口）：浓度为 5 U/ μ l ， 50 μ l 反应液中加 1U 。 8 ．消毒三蒸水 9 ． 6 ×载样 buffer 0.25% 二甲苯青 FF ， 0.25% 溴酚蓝， 30% 甘油 10 ． 50 × TAE 电泳 Buffer 12.2g Tris ， 2.85ml 冰醋酸， 10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0) ，加水至 50ml 。 11 ．溴化乙锭 (EB) 溶液 10mg/ml( 避光保存 ) ，每 100ml 琼脂糖凝胶加 5 μ l 贮存液，即凝胶中 EB 终浓度为 0.5 μ g/ml ，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。 12. DNA Marker 13 ．各种国产或进口移液器 (10 ， 20 ， 100 μ l) 14 ．消毒的 0.2ml PCR 管， 10 μ l ， 100 μ l tips 15 ．小型离心机 16 ． PCR 仪 17 ．水平电泳槽和电泳仪 18 ．紫外分析仪 【操作步骤】 取 0.2mlPCR 管，按下表操作：
用手指弹管壁混匀，稍离心，盖盖，编号。于 PCR 仪上进行 PCR 反应。 PCR 反应参数为 : 30 个 PCR 循环 . 反应参数为 : 94 ℃， 1min; 50 ℃， 1min; 72 ℃， 1min. 其中第一循环 94 ℃， 5min 。 【琼脂糖凝胶电泳】 1 ．灌胶 在进行 PCR 时预先灌好 . 称取 1g 琼脂糖，加 2ml 50 × TAE 电泳 Buffer 和 98ml 蒸馏水，在电炉或微波炉上溶解，配制成 1% 琼脂糖凝胶 100ml ，稍冷后，加 5 μ l 10 mg/ml EB ，混匀 . 安装好电泳槽和样品梳，灌胶 . 2 ．上样 在电泳槽内盛放 1 × TAE ，撕去制胶托架两端的封胶，将制胶托架装入电泳槽内，小心取出样品梳 . 取 PCR 样品 10 μ l ，加 2 μ l 6 ×载样 buffer 在 Parafilm 膜上混匀，上样 . 3 ．电泳 正确连接电极，在 100V 恒压条件进行电泳，待蓝色染料泳过 2/3 段凝胶，停止电泳 . 4 ．取出凝胶，在紫外分析仪上观察结果，判断 PCR 产物的大小。
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