实验三 凝胶过滤法分离蛋白质

【原理】

在含有血红蛋白 (Mw ＝ 64 500) 加入过量的高铁氰化钾 (K 3 Fe(CN) 6 ， Mw ＝ 327.25) ，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白 (methemoglobin ， MetHb) 。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的 MetHb 样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到 MetHb( 红褐色 ) 洗脱较快，而小分子高铁氰化钾 ( 黄色 ) 洗脱较慢，达到将 MetHb 完全分离出来的目的。

【试剂】

1 ．抗凝全血

2 ．四氯化碳 (CCl 4 )

3 ．生理盐水

4 ．交联葡聚糖 G-25( 细粒 )

5 ． 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (pH7.0)

6 ． 0.4% K 3 Fe(CN) 6 。

【操作步骤】

1 ．凝胶准备 称取 5g 交联葡聚糖 G-25 ，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约 60ml 溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复 3 次。将溶胀后的凝胶用 10 倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。

2 ．装柱 取玻璃层析柱 (25cm × 1.5cm) 一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液 8cm 左右高，将平衡后的交联葡聚糖 G-25 悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖 G-25 悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高 20cm 左右时为止。床面上覆盖 3ml 缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定 5 ～ 10min 后，接储液瓶，打开出口，用 2 倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。

3 ．样品处理

(1) 血红蛋白溶液的制备 取草酸盐抗凝全血 3ml 离心，吸去上层血浆，加入 5 倍体积的冷生理盐水，混匀后 3 000r/min 离心 5min ，弃去上清液，重复洗 3 次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加 1/2 体积 CCl 4 ，用力振摇 3min ， 3 000r/min 离心 5min 。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中 Hb 浓度约为 10%( 置 4 ℃暂存，一周用完 ) 。

(2) 样品 血红蛋白液 3 滴加 K 3 Fe(CN) 6 8 滴和蒸馏水 2 滴混合，制成 MetHb 混合样品。

4 ．上样、洗脱 打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸混合物样品 0.5ml 左右，在距离床面 1mm 处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入 1 ～ 2 倍样品量体积的洗脱液 ( 这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内 ) ，当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。

5 ．分部收集 用自动部分收集器，以 5 滴 /min ， 5min/ 管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待黄色的 K 3 Fe(CN) 6 色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。

6 ．测定 将每管收集液加入缓冲液至 4ml ，混匀，在 425nm 处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。

【注意事项】

1 ．装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。

2 ．流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。