实验二 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白

【原理】

将血清脂蛋白用苏丹黑 B 丙二醇预染，加于聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分子筛效应，因此它的分辨率高，可将血清脂蛋白各组分清晰分开。

【试剂】

1 ． TEMED

2 ． 10% 过硫酸铵溶液 称取过硫酸铵 1g 加蒸馏水溶解 10 ml 。冰箱保存不得超过 1 周。最好临用前配制。

3 ． 25% 蔗糖溶液 称取蔗糖 6.25g, 溶于 25 ml 蒸馏水中。

4 ． 0.5 Tris-0.04mol/L EDTA-Na 2 缓冲液 称取 Tris 6.057g, EDTA-Na 2 1.17g, 用蒸馏水溶解后稀释至 100ml, 调 pH 应为 8.8, 贮棕色瓶内 , 冰箱保存。

5 ． 30% Acr/Bis (W/V) 称取 29g 丙烯酰胺 (Acr) 和 1g 甲叉双丙烯酰胺 (Bis), 加 60ml 三蒸水溶解后用水补足至 100ml, 装入棕色瓶中 4 ℃保存备用。

6 ．电极缓冲液 (pH8.3) 含 25mmol/L Tris, 250mmol/L 甘氨酸 , 称取 3.0g Tris, 甘氨酸 18.8g, 加适量水溶解 ( 可适当加热 ), 不必加 HCl 调 pH, pH 正好为 8.3, 加水至 1000ml ，室温保存。

7 ．苏丹黑 B 丙二醇液 丙二醇 20ml, 加热至 100 ～ 110 ℃ , 加入 0.2g 苏丹黑 B 搅动 5min, 用 3 号新华滤纸过滤 , 此溶液在暗处保存 , 至少稳定 1 个月 .

【操作步骤】

1 ． 4% 凝胶制备 将清洁的 0.5 × 1.5cm 玻璃管若干支垂直插在橡皮座上，以备制胶。从冰箱中取出下列试剂，在室温中平衡，然后在一小三角瓶中依次加入：

30% Acr 1.3ml

Tris-EDTA-Na 2 缓冲液 1.2m1

蒸馏水 7.3ml

TEMED( 四甲基乙二胺 ) 0.01ml

10% 过硫酸铵溶液 0.5m1

( 加入过硫酸铵轻轻混合后即开始聚合。因此 , 装柱要求在 5min 内完成。 )

2 ．装柱 迅速用吸管吸取上述混合液沿管柱注入玻管中 , 每管 0.8ml-1.0ml, 随即用滴管经针头沿管壁缓慢加入蒸馏水约 0.5cm 高度以隔氧，室温静置 30min, 在凝胶表面与水之间出现清晰的界面，表示凝胶聚合己完成，倒去水层，用滤纸条轻轻吸去凝胶表面水分，注意不能损伤已聚合的凝胶表面。

3 ．样品制备与加样 取血清 0.2ml, 加苏丹黑 B 丙二醇液 0.02ml, 加 25% 蔗糖溶液 0.02ml, 混匀 , 室温放置 45min 后 , 2000r/min 离心 5min 。然后取预染血清 50 μ l, 加在凝胶面上 , 再沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端。

4 ．电泳 将加样的凝胶玻管从橡皮座上取下，插入带孔的电泳槽中，塞紧。不能漏水，凝胶管必须垂直。在上下两槽中分别注入电泳缓冲液，上槽接负极，下槽接正极，电流为 2 ～ 5mA/ 管，待第一色带到达胶管下段约 1cm 时停止电泳，一般需 20 ～ 30min 。

5 ．剥胶 将上槽缓冲液倒出（装于另一瓶内），将凝胶管取下。取一支带长针头（约 10cm) 的 2ml 注射器；吸满蒸馏水，将针头从浓缩胶一端小心地沿管壁插入其与凝胶之间，转动玻管，同时注入蒸馏水，使胶柱随水的压力及润滑作用从玻管中脱出。必要时在针剥后用洗耳球从一端缓慢吹出。

6 ．观察与作图 肉眼观察各区带的颜色深浅宽窄及其排列顺序，绘图记录之。