实验十一 DNA 的限制性内切酶酶切分析

【原理】

限制性内切酶 (restriction endonuclease ， RE) 是由细菌自己产生的能识别双链 DNA 分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的 RE ，能识别双链 DNA 的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切 DNA 分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成 RE 酶切位点的改变，故当用一定的 RE 切割时，其切开的片段 ( 分子量 ) 大小与正常人发生差异，即 DNA 限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。

实验可选用价格低廉、酶切效果好的 Eco R Ⅰ ( 识别位点 G ↓ AATTC) 对λ DNA 进行酶切，观察 RE 的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为 21 226bp ， 7 421bp ， 5 804bp ， 5 604bp ， 4 878bp 和 3 530bp 片段。

本实验是将实验十制备的人 Bcl-2 重组质粒 DNA 作为 Eco R Ⅰ酶切底物。人 Bcl-2 重组质粒是 Eco R Ⅰ单酶切的 pBluescript Ⅱ KS(-) 载体与 EcoR Ⅰ单酶切的人 Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为 4 861bp ，前者是一种由 pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。因此用 Eco R Ⅰ酶切则应得到空载 pBluescript Ⅱ KS(-) 载体 (2.96kb) 和人 Bcl-2 cDNA (1.9kb) 两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定鉴定该质粒中的插入片段。

【试剂】

1 ． DNA 底物 λ DNA 或制备的肝组织 DNA 或实验十制备的 Eco R Ⅰ非定向克隆构建的人 Bcl-2 重组质粒 DNA 。

2 ．限制性内切酶 Eco R Ⅰ及其缓冲液 只需购买国内试剂公司的产品即可，每种 RE 均配有 2 种缓冲液，在配套的缓冲液中该 RE 均可获得 100% 酶切活性。

3 ． 50 × TAE 电泳缓冲液 取 Tris24.2g ，冰醋酸 5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至 100ml 。 1 × TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。

4 ．溴酚蓝指示剂溶液 (6 ×上样缓冲液 ) 称取溴酚蓝 100mg ，加双蒸水 5ml ，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖 25g ，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50ml ，加入 NaOH 1 滴，调至蓝色。

5 ．溴化乙锭 (EB ， 1 mg/ml) 戴手套谨慎称取 EB 20mg 于棕色试剂瓶中，加 20ml 双蒸水，溶解后贮于 4 ℃备用，配制琼脂糖凝胶时每 100ml 凝胶加 50 μ l EB 。

6 ． DNA 分子量标准 根据需要购买，一般浓度为 0.5 μ g/ μ l 。

【操作步骤】

1 ．将下列试剂 缓冲液 2 μ l ，λ DNA(5 μ g) 或基因组 DNA(5 μ g) 或 质粒 DNA 样品 (1 μ g) ， EcoR Ⅰ 5 ～ 10U 加至 0.5ml EP 管中，加双蒸水至 20 μ l ，加盖，混匀后稍离心， 37 ℃水浴反应 1h 。

2 ．制备琼脂糖凝胶 按照被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表。

表 琼脂糖凝胶浓度与分辨 DNA 大小范围的关系

凝胶中的琼脂糖含量 [%(w/v)] 线性 DNA 分子的有效分离范围 (kb)

0.3 5 ～ 60

0.6 1 ～ 20

0.7 0.8 ～ 10

0.9 0.5 ～ 7

1.2 0.4 ～ 6

1.5 0.2 ～ 3

2.0 0.1 ～ 2

称取 0.8g 琼脂糖倒入三角瓶中，加入 1 × TAE 缓冲液 100ml ，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加 50 μ l EB 染色液，摇匀。

3 ．灌胶

(1) 取洁净的电泳内槽 ( 又称托盘 ) ，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好 ( 一定要封严，不能留缝隙 ) 。

(2) 将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。

(3) 将冷却至 60 ℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。

(4) 待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。

(5) 加入 1 × TAE 缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。

4 ．加样 剪取适当大小的蜡膜 (Parafilm 膜 ) ，取 6 ×上样缓冲液 1 μ l 点于膜上数点。取 5 μ l 酶切后的样品， 0.5 ～ 1 μ g 未酶切质粒 DNA ， DNA 分子量标准分别与上样缓冲液混匀。将其分别加入凝胶的点样孔 ( 记录点样顺序及点样量 ) 。

5 ．电泳 接通电源槽与电泳仪的电源 ( 检查正负极， DNA 片段是从负极向正极移动 ) 。 DNA 的迁移率与电压成正比，电压不超过 5V/cm 凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿 1 ～ 2cm 处，切断电源，停止电泳。

6 ．观察结果 取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果， DNA 存在处应显出桔红色荧光条带，可观察到酶切与未酶切后的 DNA 带的泳动位置。

7 ．摄影 在镜头前加一块红色滤光片，使用 100o 黑白胶卷，利用透射紫外光作光源，光圈 2.8 ，曝光 0.5 ～ 2s ，调准焦距，可拍摄质量较好的凝胶照片。有条件则使用 DNA 一次成像仪。

【注意事项】

1 ．本实验可先进行酶切反应，酶切过程等时间的间隙灌好琼脂糖凝胶。

2 ．进行 DNA 酶切时，要在其最适温度下 ( 大多数为 37 ℃ ) 进行。最好是用每一种酶的专用缓冲液，以达到最佳酶切效率。如遇 2 种酶酶切应先用低盐缓冲液后用高盐缓冲液，或一种酶切结束后加 TE 至 400μl ，再进行酚 / 氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。

3 ． RE 一定要在低温 ( － 20 ℃ ) 下贮存，因含 50% 甘油，在此温度下一般不会结冰，如结冰则表明冰箱温度低于 － 20 ℃，应避免结冰。新购的大包装酶，应先分装。每次吸取后均应将 RE 管放在冰盒内，用完后立即放在－ 20 ℃，每次取酶尽可能使用新的灭菌 tip ，避免污染。

4 ．进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 ℃条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 μ g DNA 。一般来说，要用 2 ～ 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。

5 ．酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。

6 ．对多个样品基因组 DNA 分别酶切电泳摄影，绘制出多个样品的 DNA 限制性内切酶图谱，即可分析作出基因诊断。

7 ．为便于电泳后直接可观察结果， EB 可在琼脂糖加热熔化至灌胶前加入。 EB 是 DNA 的诱变剂，亦是极强的致癌物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要戴手套，用过的手套要及时把手套顺手翻过来，让污染有 EB 的面朝里，有 EB 的废液和器皿要分别处理好。