实验一 过氧化氢酶 K m 的测定

【原理】

本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶 (CAT) 催化下列反应：

2H 2 O 2 2H 2 O+O 2 ↑

H 2 O 2 浓度可用 KMnO 4 在硫酸存在下滴定测知。

2KMnO 4 ＋ 5H 2 O 2 ＋ 3H 2 SO 4 2MnSO 4 ＋ K 2 SO 4 ＋ 5O 2 ↑＋ 8H 2 O

求出反应前后 H 2 O 2 的浓度差即为反应速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常数。

【试剂】

1 ． 0.05mol/L 草酸钠标准液 将草酸钠（ AR ）于 100 ～ 105 ℃ 烘 12h 。冷却后，准确称取 0.67g ，用水溶解倒入 100ml 量瓶中，加入浓 H 2 SO 4 5ml ，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。

2 ．约 0.02ml KMnO 4 储存液 称取 KMnO 4 3.4g ，溶于 1000ml 蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。

3 ． 0.004mol/L KMnO 4 应用液 取 0.05mol/L 草酸钠标准液 20ml ，于锥形瓶中，加浓 H 2 SO 4 ml ，于 70 ℃ 水浴中用 KMnO 4 贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出 KMnO 4 贮存液的标准浓度，稀释成 0.004mol/L ，每次稀释都必须重新标定储存液。

4 ．约 0.08mol/L H 2 O 2 液 取 20%H 2 O 2 （ AR ） 40ml 于 1000.0ml 量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用 0.004mol/L KMnO 4 标定之，稀释至所需浓度。

5 ． 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.0 ）。

【操作步骤】

l ．血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液 0.1ml ，用蒸馏水稀释至 10ml ，混匀。取此稀释血液 1.0ml ，用磷酸盐缓冲液 (pH7.0 ， 0.2mol/L) 稀释至 10ml ，得 1 ： 1000 稀释血液。

2 ． H 2 O 2 浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为 0.08mol/L 的 H 2 O 2 2.0ml 和 25%H 2 SO 4 2.0ml ，分别用 0.004mol/L KMnO 4 滴定至微红色。从滴定用去 KMnO 4 ml 数，求出 H 2 O 2 的 mol 浓度。

3 ．反应速度的测定：取干燥洁净 50ml 锥形瓶 5 只，编号，按下表操作。

加入物 (ml)

1

2

3

4

5

H 2 O 2 ( 约 0.08mol/L)

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

蒸馏水

3.0

2.50

2.00

1.50

1.00

将各瓶置 37 ℃ 水浴预热 5min ，依次加入 1 ： 1000 稀释血液每瓶 0.5ml ，边加边摇，继续保温准 5min ，按顺序向各瓶加 25%H 2 SO 4 2.0ml ，边加边摇，使酶促反应立即终止。

最后用 0.004mol/L KMnO 4 滴定各瓶至微红色 , 记录 KMnO 4 消耗量 (ml) 。

【计算】

1 ．

（式中： 4 为反应液量 4ml ）

2 ．反应速度的计算：以反应消耗的 H 2 O 2 mmol 数表示。

反应速度 = 加入的 H 2 O 2 mmol 数－剩余的 H 2 O 2 mmol 数

即： H 2 O 2 mol 浓度 × 加入的毫升数－ KMnO 4 0.004 mol/L× 消耗的 KMnO 4 毫升数 × 5/2

（式中： 5/2 为 KMnO 4 与 H 2 O 2 反应中 mol 换算系数）

3 ．求 K m 值：

下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的 K m 值，供计算参考。

己知 KMnO 4 为 0.004mo1/L ，标定出 H 2 O 2 浓度为 0.08mol/L ，列表计算如下：

计算程序

1

2

3

4

5

①加人 H 2 O 2 数

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

②加人 H 2 O 2 mmol= ① ×0.08

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

③底物浓度［ S ］ = ② ÷ 4

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

④酶作用后， KMnO 4 滴定 ml

1.35

3.70

6.40

9.80

13.20

⑤ 剩余 H 2 O 2 mmol= ④ ×0.004×5/2

0.0135

0.037

0.064

0.098

0.132

⑥ 反应速度 V= ②一⑤

0.0265

0.043

0.056

0.062

0.068

⑦ [S]/V= ③ ÷⑥

0.377

0.465

0.536

0.645

0.735

按前述方法作图求得 K m ＝ 0.032mol/L 。

【思考题】


l ． K m 值的意义是什么？

2 ．测酶 K m 值的实验中，需要特别注意哪些操作？